4 大肠杆菌质粒DNA的分离（碱变性法）
【试剂】
溶液I ：50 mM葡萄糖＋ 25 mM Tris-Cl＋ 10 mM EDTA，pH 8.0（灭菌处理）
即：20ml 0.5M EDTA（pH8.0）+25ml 1M Tris-Cl（pH8.0）+9.9085g葡萄糖，定容到300ml，灭菌处理。
溶液II（现配）：0.2 M NaOH ＋ 1% SDS。
即：按照0.4M NaOH∶2% SDS＝1∶1配置。
0.4M NaOH：8g NaOH水溶定容到500ml；
2%SDS：100ml 10%SDS加水定容到500ml
溶液III：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
即：294.42g 醋酸钾+115ml冰乙酸，加水定容到1000ml
3M NaAc: 122.472g NaAc,定容到300ml
5M LiCl:90.615g LiCl 加水定容到300ml
（1）收集大肠杆菌饱和培养物1.5ml至1.5 ml 离心管中，10000 rpm离心1min。
（2）弃上清，将细菌沉淀悬浮在100μl的溶液I中。
可以加入2.5μl RNase A（10mg/ml）（选用）。
（3）加200μl新配制的溶液II，盖紧管口。快速轻柔颠倒离心管5次使内容物混合，直到管内液体变的澄清。若菌体量较多，可冰置5min。
（4）加150μl预冷的溶液III，盖紧管口。将管迅速颠倒数次，此时，管内出现白色絮状物质，冰上放置20min。
（5）离心（13200rpm，4℃，5min），将上清转移到新的离心管中。
（6）（选用）加等体积苯/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀，离心同上。取上清到新的离心管中。
（7）加入2.5倍体积的无水乙醇混匀后置冰上20min，或-20℃10分钟。然后13200rpm 离心10min。
（8）小心弃上清，加入0.5ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，离心弃上清，在空气中使质粒DNA干燥10min。注意，操作小心不要将沉淀吸走。
（9）将质粒DNA溶于50μl，ddH2O中，4℃保存。
（10）若分离的质粒DNA中的RNA较多，可用氯化锂处理去除RNA。操作如下，在水溶解的质粒DNA中加入80%体积的5M LiCl,混匀，-20℃10分钟；然后13200rpm 离心10min。转移上清到新的离心管，加入2.5倍体积的无水乙醇后操作同上。
（11）溶解后的质粒DNA取2~3μl进行琼脂糖凝胶电泳检测其质量。
【注意事项】
碱变性抽提质粒过程中注意试剂的作用及其原理：
（1）溶液I的主要作用是建立后续反应的pH环境；如果细胞量较多，可以考虑同比例的增加相应试剂的用量（三种试剂必需同比例增加）。同时50 mM葡萄糖可以降低细菌在静止环境下的沉降速率，避免悬浮起来的菌体迅速沉积到管底，促进后续的菌体与溶液II的快速充分接触。而高达10mMEDTA可以螯合Ca2+和Mg2+等二价金属离子，进而抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。使用的溶液I也可以用水甚至培养基替代，但是无论使用何种溶液悬浮细胞，一定要悬浮均匀，不能有结块。
（2）溶液II由于含有NaOH，因此需要新鲜配制，这主要是由于空气中的CO2容易进入到溶液II中，从而导致pH值的降低；氢氧化钠是碱裂解破细胞抽质粒的关键，碱变性法因此而得名。因此要保证NaOH的质量。
（3）溶液II中的SDS很容易同蛋白质结合，平均两个氨基酸结合一个SDS分子，因此大量的蛋白质同SDS形成复合物。而基因组的DNA是很大的DNA分子，其上也有大量的蛋白质；基因组DNA间接的结合到SDS上，这样SDS实际上就结合了大量的蛋白质及其细胞的基因组DNA。当这些复合物遇到溶液III中的钾离子的时候，钾离子置换SDS的钠离子，能形成十二烷基硫酸钾（potassiμm dodecylsμlfate，PDS），PDS是不溶于水，加之有高浓度的盐离子，因此就形成了包括细胞内的基因组DNA和蛋白质PDS沉淀。
（4）溶液III中的2M的醋酸则是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断基因组DNA，使得难于同PDS共沉淀。因此碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是一个误会，因为变性的也好，复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
（5）酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）抽提。酚是主要的蛋白质变性试剂，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；另外，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚提取后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚提取后一定要用氯仿提取一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行提取，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
（6）虽然乙醇沉淀DNA过程中，一般加入2.5倍体积的乙醇后室温放置几min后，离心就可以将质粒DNA沉淀出来；如果放置在-20℃过长时间，则会导致大量的盐的沉淀，此时需要用70％的乙醇好好浸泡几次，以去除过多的盐离子。
（7）琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，一般能看到三条带，但这并不是我们通常认为的超螺旋、线性和开环这三条带。碱法提取得到质粒样品中不含线性DNA。当用某种限制性核酸内切酶线性化质粒后进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。事实上，一般认为这三条带以电泳速度的快慢依次是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果在加入溶液II后操作不小心打断基因组DNA，则会出现一条甚至多条10K以上的大的条带，这可能就是基因组DNA的碎片。
})
