10.二维电泳（2-DE）

10.1二维电泳技术简介

　　Smithies和poulik最早引入了二维电泳技，他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合起来分离血蛋白质。随后，二维电泳技术经历了更多的发展。丙烯酰胺介质的引入，特别是等电聚焦技术的应用，使人们能够基于蛋白质电属性对其进行分离。二维电泳的双向可以有以下不同的组合，但最常用的是第一向等电聚焦和第二向SDS电泳。特别是固相IPG胶条技术的成熟，使得此方法简便易行，重复性得到很好的保证，因此得到广泛应用。

10.2　二维电泳步骤

10.2.1　样品制备

　　样品制备是二维电泳的第一步，也是至关重要的一步，直接影响到结果的好坏。样品的制备原则根据自己的实验目的不同而有所不同。使用不同的方法可以获取不同的蛋白，如全蛋白，可溶性蛋白，膜蛋白以及其它类蛋白等等。蛋白溶解所用的Buffer一般应包括以下成分：

（1）变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。

（2）表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。

（3）还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原，DTT在碱性条件下会变性，若分离碱性蛋白最好使用TBP。

（4）其它成分：根据需要添加，如蛋白酶抑制剂，核酸酶等，但要注意不能使Buffer的离子浓度有所增加，否则在IEF之前还要进行除盐。

以下是几种文献报道较多的裂解液配方：

（1）Lysis buffer A

　　9 M urea，4%w/v CHAPS，1%w/v DTT，0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors

（2）Lysis buffer B

　　7 M urea，2 M thiourea，4%w/v CHAPS，1%w/v DTT，0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors

（3）Lysis buffer C

　　40 mM Tris-base（pH 9.5）in ultrapure H₂O

（4）Lysis buffer D

　　8 M urea，4%CHAPS，40 mM Tris（base）

（5）Lysis buffer E

　　5 M urea，2 M thiourea，2%SB 3-10，2%CHAPS，1%w/v DTT，0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors

（6）Lysis buffer F

　　100μL SDS sample solution（1%w/v SDS，0.375 M Tris-HCl，pH 8.8），50 mM DTT，25%v/v glycerol

【注意事项】

（1）CA（carrier ampholyte，载体两性电解质）、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。

（2）其中C-F是分步法提取的4种裂解液配方，C适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F适于提取难溶的沉淀蛋白。

细胞破碎

　　细胞的破碎也没有统一的方法，可以根据自己的实验材料选择适当的破碎方法。一般微生物可以采用超声波破碎的方法，此法的好处是可以对细胞内的核酸起到一定的降解作用，一般不需要再额外进行核酸处理，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，而且对一些大分子蛋白也会有一定的分解作用，最好在冰上操作，且要间歇操作，最好在Buffer中加入蛋白酶抑制剂。其它的样品也可以根据需要采用其它的细胞破碎方法，如石英砂碾磨、玻璃匀浆器匀浆、反复冻融等。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶的活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。一般细胞破碎后，12,000 rpm离心30 min 后取上清即可，如果杂质较多，可以进行TCA丙酮沉淀，进一步纯化蛋白。

10.2.2等电聚焦

　　试验中所用的缓冲液配方见附录。

（1）从－20℃冰箱中取出保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。

（2）在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lytel（pH3～10，可通用各种PH胶条）2.5ml，充分混匀。

（3）从小管中取出水化上样缓冲液，加入蛋白样品，充分混匀。根据不同的胶条选择上样量，但蛋白样品不宜过多，一般不能高于总体积的一半，也不可太少，以减少误差，因此对蛋白浓度有一定的要求。下表显示的是通常推荐使用的双向电泳第一向蛋白上样量。因为样品和样品之间存在差异，所以这种上样量仅提供参考。对于窄pH范围的IPG胶条，需要比宽pH范围的IPG胶条上更多的样品，这是因为pI值不在此范围内的蛋白质在等电聚焦的过程中会走出胶条。单pH范围IPG胶条的上样量是通常的4～5倍还多，这样就可以很好的检测低丰度的蛋白质。

IPG胶条的长度	分析型的上样量 （银或SYPRO Ruby染色）	制备型的上样量 （考马斯亮蓝染色）
7 cm	10～100ug蛋白	200～500ug蛋白
11cm	50～200ug蛋白	250～1,000ug蛋白
17cm	100～300ug蛋白	1～3mg蛋白

　　样品溶液的上样体积见下表。这样就可以使胶条溶胀至它们原来的厚度（0.5mm）。胶条最少需要经过11小时的溶胀。即使看上去所有的缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条在槽中溶胀充分的时间。只有在IPG凝胶的孔径已经溶胀充分后，才可以吸收大分子量蛋白质，否则大分子量蛋白质无法进入胶条。

IPG胶条的长度	上样体积
7 cm	125～250ul
11cm	185～370ul
17cm	300～600ul

（4）从－20℃冰箱取出保存的IPG预制胶条，室温放置10分钟。

（5）将配好的样品加入聚焦盘或水化盘。可以沿着槽的边缘从左到右线性加入样品，也可将样品加到槽子中间一点。注意不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。

（6）将蛋白质样品加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。胶条两面中较薄较软的一面为保护层，从撕下保护层起要时刻注意不要破坏胶面，不要使胶面碰到其它物品，以免污染杂质。

（7）分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

（8）在每根胶条上覆盖2～3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

（9）对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。如果采用水化盘被动水化，水化完成后要将胶条转移到聚焦盘中，再设置聚焦程序。

一般建议程序如下设置，根据结果再来协调各步骤。

7cm胶条：　　 水化　　　　　 　 50V　　　　　　 　 12～16小时（17℃） 　　 　　　主动水化

　 　　 S1　　　　　 　 250V　　　　　 　 线性　　　　　 30分钟　　　　　　　　　　　　　　　　 除盐

　 　　 S2　　　　　 　 500V　　　　　 　 快速　　　　　 30分钟　　　　　　　　　　　　　　　　 除盐

　　 S3　　　　　 　 4000V　　　　　 　 线性　　　　　 3小时　　　　　　　　　　　　　　　　　 升压

　　 S4　　　　　 　 4000V　　　　　 　 快速　　　　　 20,000伏小时　　　　　　 　　聚焦

　　 S5　　　　　 　 500V　　　　　 　 快速　　　　　 任意时间　　　　　　　　　　 　　 保持

选择所放置的胶条数；设置每根胶条的极限电流（30～50mA/根）；设置等电聚焦时的温度（17℃）。

11cm胶条：　　　 水化　　　　　　 50V　　　　　　　　　 12～16小时（17℃）　　　　　　　　 主动水化

S1　　　　　　　　 250V　　　　 　　 线性　　　　 30分钟　　　　　　　　　　　　　　　　 除盐

S2　　　　　　　　 1000V　　　　　　　　 快速　　　　　 30分钟　　　　　　　　　　　　　　　　 除盐

S3　　　　　　　　 8000V　　　　　　　　 线性　　　　　 4小时　　　　　　　　　　　　　　　　　 升压

S4　　　　　　　　 8000V　　　　　　　　 快速　　　　　 40,000伏小时　　　　　　 　 聚焦

S5　　　　　　　　 500V　　　　 　　 快速　　　　 任意时间　　　　　　　　　　 　 保持

选择所放置的胶条数；设置每根胶条的极限电流（50mA/根）；设置等电聚焦时的温度（17℃）。

17cm胶条：　 水化　　　　　　 50V　　　　　　　　　　 12～16小时（17℃）　　　　 　　　　　　 主动水化

S1　　　　　 　　250V　　　　　 　　 线性　　　　 30分钟　　　　　　　 　　　　　　　 除盐

S2　　　　　 　　1000V　　　　　　　　　 快速　　　　　 1小时　　　　　　　　　　　　 　　除盐

S3　　　　　 　　10000V　　　　　　　　 线性　　　　　 5小时　　　　　　　　　　　　　　　　　 升压

S4　　　　　 　　10000V　　　　　　　　 快速　　　　　 60,000伏小时　　　　　　 　　 聚焦

S5　 　　　　　　 500V　　　　 　　 快速　　　　 　任意时间　　　　　　　　 　　 保持

　　选择所放置的胶条数；设置每根胶条的极限电流（50～70mA/根）；设置等电聚焦时的温度（17℃）。

（10）聚焦结束的胶条。立即进行平衡，第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，－70℃冰箱保存。

10.2.3 SDS-PAGE

（1）配制10%或12%的丙烯酰胺凝胶。注意保证每一块胶的大小一致，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。

（2）待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

（3）从－20℃取出胶平衡缓冲液母液使其溶解。

（4）配制胶条平衡缓冲液I和II。不同长度的胶条，所用的胶条平衡缓冲液体积可参考下表。

胶条的长度	7cm	11cm	17cm
胶条平衡缓冲液I	2.5ml	4ml	6ml
胶条平衡缓冲液II	2.5ml	4ml	6ml

（5）在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。如果是放在－70℃冰箱中的胶条，需先于室温放置10分钟，使其溶解。

（6）将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I，将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃12～13分钟（>10min ，<15min ）。

（7）第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I，并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃12～13分钟（>10min ，<15min ）。

（8）用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体，将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

（9）将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

（10）将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

（11）第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II，并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

（12）将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。

（13）将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

（14）用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

（15）放置几分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固，可以将胶板放在4℃以助其凝固。

（16）在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。

（17）在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20～30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

（18）电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

（19）进行染色。

虽然二维电泳的操作已经变得越来越简单，但是现阶段要得到较好的实验结果，经验因素仍然是不可或缺的。因此建议新接触二维电泳的同学做好充分的准备，多与有经验的同学交流。很少有同学第一次实验就可以做的很好的，因此在前期摸条件的过程中要注意总结经验教训，根据所跑出来的图进行有针对性的改进，这样可以快速上手，进步更快。

10.3 二维电泳中所用缓冲液配方

水化上样缓冲液（I）：　 尿素　　　　　　　　　　　　　 　　　　 8M　　　　　　　　　　　　　　　 4.805g

CHAPS 　　　　　　　　　　　 4%　　　　　　　　　　　　　　　 0.4g

DTT　　　　　　　　　　　　　　　 65mM　　　　　　　　　　　　 0.098g（现加）

Bio-Lyte　　　　　　　　　　　　 0.2%（w/v）　　 　 50ml（40%）（现加）

溴酚蓝　　　 　　 　　　　 0.001%　　　　　　　　　　　　 10ml（1% 溴酚蓝）

MilliQ水　 定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，－20℃冰箱保存。

水化上样缓冲液（II）： 尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　　 7M　　　　　　　　　　　　　　　 4.2g

硫脲　　　　　　　　　　　　　　　 2M　　　　　　　　　　　　　　　 1.52g

CHAPS 　　　　　　　　　　　 4%　　　　　　　　　　　　　　　 0.4g

DTT　　　　　　　　　　　　　　　 65mM　　　　　　　　　　　　 0.098g（现加）

Bio-Lyte　　　　　　　　　　　　 0.2%（w/v） 　　　　　 50ml（40%）（现加）

溴酚蓝　　　　　　　　 　　 0.001%　　 　　 　　　　 10ml（1% 溴酚蓝）

MilliQ水　 定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

水化上样缓冲液（III）：尿素　　　　 　　 　　　　　　　　 5M　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.0g

硫脲　　　　　　　　　　　　　　　 2M　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.52g

CHAPS 　　　　　　　　　　　　 2%　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.2g

SB 3-10 　　　　　　　　　　　 2%　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.2g

DTT　　　　　　　　　　　　　　 65mM　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.098g（现加）

Bio-Lyte　　　　　　　　　　　 0.2%（w/v）　　 　　 　　　　 50ml（40%）（现加）

溴酚蓝　　　 　　 　　　　 0.001%　　　　　　　 　　 　　　　 10ml（1% 溴酚蓝）

MilliQ水　　 定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液母液：　 尿素　　　　　　　　　　　　　 6M　　　　　　　　　　　　　　　 36g

SDS　　　　　　　　　　 2%　　　　　　 　　　　 2g

Tris-HCl　　　　　　 0.375M pH8.8　　　　　　 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）

甘油　　　　　　　　　 20%　　　　　　　　　　　　　　 20ml

MilliQ水定容至100ml，分装成10管，每管10ml，－20℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液I：　　 胶条平衡缓冲液母液　　　　　 10ml

DTT　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.2g　　　　 充分混匀，用时现配。

胶条平衡缓冲液II：　 胶条平衡缓冲液母液　　　　　 10ml

碘乙酰胺　　　　　　　　　　　　　　　 0.25g　　　 充分混匀，用时现配。

低熔点琼脂糖封胶液： 低熔点琼脂糖　 　　 0.5%　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　 0.5g

Tris　　　　　　　　　　　　　　　 25mM　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.303g

甘氨酸　　　　　　　　　　　　 192mM　　　　　　　　　　　　　　　　 1.44g

SDS　　　　　　　　　　　　　　　 0.1%　　　　　　　　　　　　　　 　 1ml（10% SDS）

　　　　 　　　　　　　　　　　　　 溴酚蓝　　　　　　　　　　　　　 0.001%　　　　　　　　　　　　　　　　 100ml（1%溴酚蓝）

MilliQ水定容至100ml，加热溶解至澄清，室温保存。

30% 聚丙烯酰胺贮液： 丙烯酰胺　　　　 　 150g

甲叉双丙烯酰胺 　 4g

　 　 MilliQ水　　　　　　 　 500ml　 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。

1.5mol/L Tris碱 pH8.8：Tris碱　　　 　　　 90.75g

MilliQ水400ml，用1mol/L HCl调pH至8.8，再加MilliQ水定容至500ml，4℃冰箱保存。

10% SDS：　 SDS　　　　　 　　　 10g

　　　 　　　　　　 MilliQ水100ml，混匀后，室温保存。

10% Ap：　 Ap　　　　　　 　　　 0.1g

　 　　　　　　 MilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4℃冰箱保存。

10×电泳缓冲液（1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）：

Tris碱　　　　 　　　 30g

甘氨酸　　　　　　　　　　　　　 144g

SDS　　　　　　　　　　　　　　　 10g

MilliQ水1L，混匀后，室温保存。