实时无标记分子相互作用仪- Biolayer Interferometry (BLI)

在 BLI 实验中，一个分子被固定在浸读式传感器表面，检测另一个可结合的分子。第二个分子的结合导致传感器产生干涉位移，通过实时监测位移变化，从而得到结合曲线。结合和解离过程是在样品板的不同孔间完成。ForteBio Octet采用生物膜干涉技术，无需标记，可以实时定量测试，检测结果准确、客观、可信。

应用和特点

主要应用

• ●  动力学: ka, kd

• ●  亲和力: KD

• ●  大分子和小分子结合

Octet RED96e 主要特征

• ●  同时实时检测8个传感器

• ●  一次性传感器（传感器的再生是非必需的）

• ●  基于96孔的样品板设计

• ●  可用于检测小分子

理论基础

Bio-Layer Interferometry (BLI) 生物膜干涉技术即一种通过检测干涉光谱的位移变化来检测传感器表面反应的技术；当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。任何由于分子结合或解离而形成的膜层厚度和密度变化，能够通过干涉光谱的位移值而体现，并通过这个位移值做出实时的反应监测图谱。

BLI 实验步骤

在BLI实验中有两个主要的实验步骤，分别是 Immobilization 和 Interaction analysis，其中的每一步骤都需要优化。Regeneration 是可选的步骤，如果想用一根传感器重复检测多个样本，那么就要添加再生步骤。

Immobilization

• ●  固定的分子可逆或不可逆的结合到传感器表面

Interaction analysis

• ●  在结合阶段，Analyte 结合到传感器表面

• ●  在解离阶段， Analyte 从传感器表面离开

Regeneration

• ●  将传感器表面的Analyte或者ligand 去除

 

Bio-Layer Interferometry (BLI) Technology from ForteBio

Octet RED96 Product Information from ForteBio

Purchase BLI Dip and Read sensors from ForteBio

measuring kinetics using BLI from ForteBio

Bio-Layer Interferometry (BLI) Technology page from ForteBio

Purchase BLI Dip and Read sensors from ForteBio

耗材:

• ●  ForteBio Dip and Read sensors

• ●  Black 96-well plate to soak sensors

• ●  Black 96-well for samples and reagents

Popular ForteBio Dip and Read Biosensors for Kinetics*	Part Number
Streptavidin (SA) biosensors	18-5019 (96/tray)
High Precision Streptavidin (SAX) biosensors	18-5117
Super-Streptavidin (SSA) biosensors (for small molecules)	18-5057
anti-His (HIS1K) biosensors	18-5120
Ni-NTA (NTA) biosensors	18-5101
Anti-Human IgG Fc biosensors	18-5010

* See ForteBio website for more sensor types

OCTET Black Microplates**	Part Number
Greiner Bio-One 96-well black flat-bottom PP, 200 µL	655209 (VWR 82050-784)

** Only Greiner Bio-One brand, black microplates or ForteBio plates are recommended by ForteBio for the Octet sample and reagent plate.

样品准备

缓冲液

●  BLI兼容大多数缓冲液，推荐使用蛋白稳定的缓冲液

●  为了消除非特异性扩增，可添加 0.05% Tween 20 (or other surfactant)

    ○ 表面活性剂浓度范围 0.02-0.1%

●  稀释样本所用缓冲液应与 baseline，association phase 和 dissociation phase一致

    ○ 对于一些高折光率的溶液（如DMSO）缓冲液一致尤为重要

●  0.1% BSA 也能降低非特异性结合

    ○ ForteBio 销售 detergent-based Kinetic Buffer (PBS + 0.02 % Tween20, 0.1 % BSA, 0.05 % sodium azide) 

    ○ 注意: BSA 有时也能够引入非特异性结合

样本

●  BLI 实验需要一种分子固定在传感器表面 ( the Load Sample)，另一种分子在96孔样品板中(the Analyte Sample)

●  精确测定浓度

    ○ the Load Sample浓度影响信号强度

    ○ the Analyte Sample浓度直接影响 KD 值

●  蛋白聚集会影响BLI实验

    ○ 实验开始前过滤或离心样本

    ○ 可用光散射评价蛋白的均一性

    ○ 纯化的蛋白样品如果有可溶性的聚集可以通过 size-exclusion chromatography 去除

●  初次尝试的浓度范围:

    ○ Load Sample (immobilized) 10-50 µg/ml (~µM range)

    ○ Analyte 0.01 – 100 * KD (0.1 – 10 * KD)

●  96孔板装样体积

    ○ 96-well 200 µl

 

新手入门

Octet 实验由多个步骤组成，浸读式传感器在微孔板不同孔间移动。

仪器 Red96e 最多可以同时使用8根传感器 。

缓冲液和样品加在黑色的96孔板中。

 

实验设计注意事项

●  不要过量固定样品

●  如果 baseline 和 dissociation 步骤在同一个buffer孔中进行，那么建议勾选 processing 中的 step 4 (inter-step correction)

●  对于小分子实验，可选用 Super-Streptavidin sensors 传感器，另外还可以用 biocytin (biotinyl-lysine at 10 µg/mL)封闭传感器

●  扣除参比o Reference sample well 是指没有analyte的样品孔

    o Reference sensor 是指没有load样品，但是应用了相同的分析物浓度梯度

    o Double Reference 是指同时扣除 reference well 和 reference sensor

●  建议一次实验在3小时内完成 (10 % volume loss ~ 3.5 hours at 30 ˚C)

 

数据收集

数据收集前的准备

• ●  提前一天在大型仪器共享平台上预约

• ●  手机开电，然后手动开电脑主机和仪器电源

• ●  建议在加样前先在 Data Acquisition software 上设计好实验

实验数据收集

0. 启动 Octet Data Acquisition Software

• ●  a. 桌面上双击Data Acquisition运行操作软件，仪器初始化，1分钟内完成后显示“Ready”状态。

• ●  b. 选择Basic Kinetics

• ●  c. 点击下一步

• ●  d.软件上方有5个步骤指导一步一步完成实验设置

1. Plate Definition:

• ●  选择样品孔并且定义样品孔

• ●  右键更改样品类型，右侧表格中输入样品名称、浓度等信息，分析物必需要有摩尔浓度。

• ●  为了校正基线漂移需要包含零浓度

• ●  根据设计将样品按序加入样品板

2. Assay Definition:

• ●  点击Add添加分析步骤，设置时间和步骤名称

• ●  将➔移动至目标步骤，然后在左侧相应的样品位置双击选中样品，添加到Assay steps中

• ●  选择传感器类型

通过Threshold Params控制样品固化信号

Sample steps (s):

(1) 基线 120 (60 – 300)

(2) 固定 120 (120 – 600)

(3) (封闭) 60 (30 – 120) optional quench (eg. Biocytin on SA or SSA)

(4) 结合 300 (60 – 600)

(5) 解离 600 (60 – 600+)

(6) 转速 1,000 RPM.

3. Sensor Assignment:

• ●  建议输入传感器lot信息，方便后续进行troubleshooting。

• ●  传感器可重复使用时，选中“replace biosensor after use” 。

• ●  传感器默认放置在第1列，如果传感器放置于第n列，将前面n-1列传感器选中，然后remove。

• ●  传感器类型可右键菜单进行更改。

4. Review Experiment:

• ●  通过黑色箭头预览实验步骤，如果需要可返回修改不符合预期的步骤。

5. Run Experiment:

• ●  选择结果数据存贮位置（本地电脑）

• ●  实验名称

• ●  程序是否延迟开始，例如传感器需预湿、样品温度需平衡等。

• ●  实验温度

• ●  数据采集频率

• ●  在仪器开始运行前，确认传感器和样品板是否正确放置。点击GO，开始运行实验。

   

数据分析

1. Data selection

• ●  打开方式①：file→load a folder(数据存贮位置)

• ●  打开方式②：通过文件夹路径，找到动力学结果（粉红色），双击load

• ●  在loaded的结果中单击打开待分析的结果。

• ●  分析传感器选择。

• ●  分析步骤，可右键更改实验步骤类型，去掉不需要分析的步骤。例如,association→baseline

2. Processing

• ●  step1：data selection中预览原始数据raw data view，在sensor selection进行reference sensor和reference well选择

• ●  step2：选择信号扣除方式

• ●  step3：Y轴信号归零（通常选择平衡的最后5秒）

• ●  step4：选择align to dissociation消除gap

• ●  step5：单击process data处理数据。（选中√，数据降噪处理。（结合时间短，结合曲线可能会扭曲））

3. Analysis

• ●  选择用于数据分析的步骤，通常结合解离都分析

• ●  选择拟合模型

• ●  选择local或global拟合，如果是global，通过传感器或颜色进行分组

• ●  根据需要选择数据拟合的时间

• ●  单击fit curves拟合数据

• ●  选择export data，导出结果

   

关机

1. 从仪器中取出 sensor tray 和 reagent plates

2. 关闭仪器舱门

3. 退出软件，电脑关机，关闭仪器

4. 清洁台面卫生

5. 手机关电，退出大仪共享系统