等温滴定量热仪-Isothermal Titration Calorimetry (ITC)

仪器介绍

等温滴定量热法是一种用于量化研究各种生物分子相互作用的技术。它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量，实验数据以热谱图形式表示，提供了有关反应中物质的量（滴定终点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度等信息，并可准确的获得生物分子相互作用的完整热力学信息：结合常数（Ka)、反应化学量(n)、焓(∆H)和熵（ΔS）。因此，通过对ITC数据的分析，可阐明潜在的分子相互作用机制。

ITC实验测定的热量包括结合热，稀释热，进样热以及一些其它的热量，因此 ITC 必须要设定对照实验。因此，一对样本至少包括两次滴定：

1. 样品 A (滴定针) 滴定到 样品 B (样品池)

2. 样品 A (滴定针) 滴定到 缓冲液 (样品池)

 

ITC 技术原理

• 功率补偿

• ITC 通过测量吸热和放热，提供反应热力学的信息

测定参数：

• 结合常数:  KD

• 化学计量比：n

• 热力学参数：ΔG， ΔH， -TΔS

主要特点：

• 非标记

• 可获得热力学参数

• 无耗材

• 基本上兼容任何缓冲或添加剂

• 对大分子和小分子同样有效

• ITC 小体积 - 190 µL 样品池

• 可进行任2到80℃温度范围内的等温反应

注意事项

• 提前一天在大型仪器共享平台上预约

• 手机开电，然后手动开电脑主机和仪器电源

• 滴定针和加样针 (平台提供）

• 清洗剂Decon90和纯水（自备）

样品准备

缓冲液

• 为了降低背景热，实验需要的两种分子的缓冲液必须一致

• 准备匹配样本的缓冲液用来稀释样本，润洗样品池，进样针和滴定针

• DMSO 的稀释热非常高，因此需要样品池与滴定针里的DMSO浓度高度一致

• pH 值的微小差异也会引起很高的稀释热（建议用透析液稀释样品）

• 还原剂能够引起显著的基线漂移和假阳性。可用TCEP代替 β-Me和 DTT，浓度尽可能的低于1mM，特别是当焓变很小的时候

• 缓冲液脱气可有效减少气泡，提高数据质量

样品

• 一次实验需要的体积：

• ≥ 350 µL 蛋白（样品池）

• ≥ 60 µL 配体 （滴定针）

• 可尝试的初始浓度：

• 5-50 µM 蛋白 (至少 10x Kd)

• 50-500 µM 配体 (≥10x 样品池浓度)

• 精确测定摩尔浓度

• 样品池中的浓度误差会影响 stoichiometry

• 滴定针中的浓度误差会直接影响 KD, ΔH 和 n

• Protein aggregates 会干扰 ITC实验

• 实验开始前离心或过滤样品

• 可用光散射评价蛋白的均一性

• 纯化的蛋白样品如果有可溶性的聚集可以通过 size-exclusion chromatography 去除

Nano-ITC 开机

• 等待电脑检测到仪器，点击桌面快捷 软件launch ITCRun

• 界面会弹出以下信息(开机后，滴定头不在起始位置，请确定执行）

• The buret has not been Home Reset since the instrument was powered,Please click ok to Home Reset the buret.默认执行“确定”进入下界面

• 根据页面提示检查滴定头（确保滴定注射器取下，重新安装好空的滴定头） 点击OK后即可

• 检查online绿色指示标志，及热流信号，确认联机正常

Nano-ITC 控制软件

 

Nano-ITC  样品前处理

样品前处理

• 准备约50mL的缓冲溶液（用来润洗样品池及注射器，或者实验结束后先用缓冲溶液清洗样品池）

• 将样品（滴定物和被滴定物）及上述的缓冲溶液一起放入degassing station 脱气处理

• Degassing station 设置温度（测试滴定实验温度），真空度400mmHg以上，脱气时间10min

Nano-ITC  装样品

样品池

• 用装样针取准备好的缓冲液（推荐与样品相同的缓冲液）润洗样品池3~5次

• 抽净样品池内的缓冲溶液，用上样针取样品（小体积池的建议最少300uL，标准体积池的1200uL）加注到样品池内。（注意上样针刚好接触样品池底后加注，以免内部有气泡产生）

参比池

• 用装样针取脱好气的水润洗样品池3~5次

• 抽净样品池内的润洗水，用上样针取去离子水加注到参比品池内，使水刚好溢出样品池口

• 用长镊子加持参比管加入参比池内

滴定注射器装样

• 仔细地将滴定物装载到注射器内，确保注射器内没有气泡（可以先将气泡集中到注射器前端，在用推杆移除）

• 将注射针筒按照螺纹方向悬转安装在滴定头上，将多余的溢出样品擦干净

• 将组装好的滴定注射器小心的装在仪器上

Nano-ITC  实验后的清洗

• 为了确保安全，请检查实验结束后温度降到20~30度后在进行以下步骤

• 从主机上移除含有注射针的滴定头，利用上样针将样品从样品池尽量取净

• 将清洁套件小心插入样品池，分别连接degassing station 和装有清洁剂或去离子水的容器

• 所对应的附件连接后，开启Degassing station 后，选择Clean量程，清洗流程开始工作，清洗剂或去离子水流经样品池清洁，而后流入废液容器收集

• 先以300ml的清洗剂（如Contrad70，Decon90）清洗

• 再以1升干净的去离子水清洗

• 进样针和滴定针也要经过清洗剂和水的清洗

Nano-ITC  数据分析

• 点击运行Launch NanoAnalyze

• 执行File-Open 选择.csc;.jet;*.nitc，可能的话同时打开一空实验文件点击左面序列目录中文件，进入Data Columns 页面

• 点击Aanlysis，进入Baseline页面

• 输入/填全 滴定实验参数

• 选择合适的需要的拟合模型的页面

• 拟合控制参数（经过很好的拟合后，有些点可能被视为异常值。这些点被放弃，重新再拟合一旦有点被重选或被剔除，先前的拟合结果就被丢弃拟合完成，K和n等值被显示在右上角的视窗中）

• 叠图处理 File-New Overly Graph

• 拖动数据文件到右面的原始文件区域

• 托动数据文件到右面的第二文件区域。 这可以用作原始的相同数据文件，也可以用作不同的量图

• 通过右面Graph Setting中Split Graph  生成下图分开显示状态

• 通过右面Graph Setting中选不同界面可以对输出图进行编辑

• 执行快捷工具条中 Export to Clipboard or Export to file 可以对数据进行导出处理

• 执行快捷工具条中 Export to Clipboard-Image 进入对话框，选择好参数，Export 即可输出图谱

• 更详细清晰的数据分析请参考计算机中安装在TA Instruments –NanoAnalyze-Software Guide对应的 PDF file

如何获取高质量ITC数据

1. 认真了解你的样品（样品性质，缓冲液等）

2. 合适的运行条件和参数（温度，转速，体积等）

3. 检查仪器运行功率，判断仪器状态

4. 样品脱气处理(真空、离心）

5. 正确上样，避免气泡

6. 用水滴水检查仪器性能

7. 彻底清洗样品池，进样针，滴定针

关机

1. 清洗仪器和针

2. 退出软件，电脑关机，关闭仪器

3. 清洁台面卫生

4. 手机关电，退出大仪共享系统