二维电泳(2-DE)
发布时间:2011年03月07日     点击次数::
  • 10.二维电泳(2-DE

    10.1二维电泳技术简介

      Smithiespoulik最早引入了二维电泳技,他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合起来分离血蛋白质。随后,二维电泳技术经历了更多的发展。丙烯酰胺介质的引入,特别是等电聚焦技术的应用,使人们能够基于蛋白质电属性对其进行分离。二维电泳的双向可以有以下不同的组合,但最常用的是第一向等电聚焦和第二向SDS电泳。特别是固相IPG胶条技术的成熟,使得此方法简便易行,重复性得到很好的保证,因此得到广泛应用。

    10.2 二维电泳步骤

    10.2.1 样品制备

      样品制备是二维电泳的第一步,也是至关重要的一步,直接影响到结果的好坏。样品的制备原则根据自己的实验目的不同而有所不同。使用不同的方法可以获取不同的蛋白,如全蛋白,可溶性蛋白,膜蛋白以及其它类蛋白等等。蛋白溶解所用的Buffer一般应包括以下成分:

    1)变性剂:通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。

    2)表面活性剂:经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后,还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100NP-40、两性离子去污剂CHAPSOBG等。其中CHAPSSB3-10最好。

    3)还原剂:在变性剂和表面活性剂联用条件下,加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全,溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT-巯基乙醇,以及不带电荷的三丁基膦(TBP)进行还原,DTT在碱性条件下会变性,若分离碱性蛋白最好使用TBP

    4)其它成分:根据需要添加,如蛋白酶抑制剂,核酸酶等,但要注意不能使Buffer的离子浓度有所增加,否则在IEF之前还要进行除盐。

    以下是几种文献报道较多的裂解液配方:

    1Lysis buffer A

      9 M urea4%w/v CHAPS1%w/v DTT0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors

    2Lysis buffer B

      7 M urea2 M thiourea4%w/v CHAPS1%w/v DTT0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors

    3Lysis buffer C

      40 mM Tris-basepH 9.5in ultrapure H2O

    4Lysis buffer D

      8 M urea4%CHAPS40 mM Trisbase

    5Lysis buffer E

      5 M urea2 M thiourea2%SB 3-102%CHAPS1%w/v DTT0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors

    6Lysis buffer F

      100μL SDS sample solution1%w/v SDS0.375 M Tris-HClpH 8.8),50 mM DTT25%v/v glycerol

    【注意事项】

    1CAcarrier ampholyte,载体两性电解质)、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。

    2)其中C-F是分步法提取的4种裂解液配方,C适于提取水溶性蛋白,D是经典配方,E适于提取膜蛋白配方,F适于提取难溶的沉淀蛋白。
    细胞破碎
      细胞的破碎也没有统一的方法,可以根据自己的实验材料选择适当的破碎方法。一般微生物可以采用超声波破碎的方法,此法的好处是可以对细胞内的核酸起到一定的降解作用,一般不需要再额外进行核酸处理,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,而且对一些大分子蛋白也会有一定的分解作用,最好在冰上操作,且要间歇操作,最好在Buffer中加入蛋白酶抑制剂。其它的样品也可以根据需要采用其它的细胞破碎方法,如石英砂碾磨、玻璃匀浆器匀浆、反复冻融等。无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶的活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。一般细胞破碎后,12,000 rpm离心30 min 后取上清即可,如果杂质较多,可以进行TCA丙酮沉淀,进一步纯化蛋白。

    10.2.2等电聚焦

      试验中所用的缓冲液配方见附录。

    1)从-20℃冰箱中取出保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解。

    2)在小管中加入0.01g DTTBio-LytelpH310,可通用各种PH胶条)2.5ml,充分混匀。

    3)从小管中取出水化上样缓冲液,加入蛋白样品,充分混匀。根据不同的胶条选择上样量,但蛋白样品不宜过多,一般不能高于总体积的一半,也不可太少,以减少误差,因此对蛋白浓度有一定的要求。下表显示的是通常推荐使用的双向电泳第一向蛋白上样量。因为样品和样品之间存在差异,所以这种上样量仅提供参考。对于窄pH范围的IPG胶条,需要比宽pH范围的IPG胶条上更多的样品,这是因为pI值不在此范围内的蛋白质在等电聚焦的过程中会走出胶条。单pH范围IPG胶条的上样量是通常的45倍还多,这样就可以很好的检测低丰度的蛋白质。

    IPG胶条的长度

    分析型的上样量

    (银或SYPRO Ruby染色)

    制备型的上样量

    (考马斯亮蓝染色)

    7 cm

    10100ug蛋白

    200500ug蛋白

    11cm

    50200ug蛋白

    2501,000ug蛋白

    17cm

    100300ug蛋白

    13mg蛋白

      样品溶液的上样体积见下表。这样就可以使胶条溶胀至它们原来的厚度(0.5mm)。胶条最少需要经过11小时的溶胀。即使看上去所有的缓冲液都已经被吸收,也一定要确保胶条在槽中溶胀充分的时间。只有在IPG凝胶的孔径已经溶胀充分后,才可以吸收大分子量蛋白质,否则大分子量蛋白质无法进入胶条。

     IPG胶条的长度

    上样体积

    7 cm

    125250ul

    11cm

    185370ul

    17cm

    300600ul

    4)从-20℃冰箱取出保存的IPG预制胶条,室温放置10分钟。

    5)将配好的样品加入聚焦盘或水化盘。可以沿着槽的边缘从左到右线性加入样品,也可将样品加到槽子中间一点。注意不要产生气泡,否则影响到胶条中蛋白质的分布。

    6)将蛋白质样品加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。胶条两面中较薄较软的一面为保护层,从撕下保护层起要时刻注意不要破坏胶面,不要使胶面碰到其它物品,以免污染杂质。

    7)分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。

    8)在每根胶条上覆盖23ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

    9)对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。如果采用水化盘被动水化,水化完成后要将胶条转移到聚焦盘中,再设置聚焦程序。

    一般建议程序如下设置,根据结果再来协调各步骤。

    7cm胶条:   水化         50V          1216小时(17℃)         主动水化

         S1          250V         线性       30分钟                  除盐

         S2          500V         快速       30分钟                  除盐

         S3         4000V         线性       3小时                   升压

         S4         4000V         快速       20,000伏小时         聚焦

         S5          500V         快速       任意时间              保持

    选择所放置的胶条数;设置每根胶条的极限电流(3050mA/根);设置等电聚焦时的温度(17℃)。

    11cm胶条:    水化        50V          1216小时(17℃)          主动水化

    S1          250V         线性      30分钟                  除盐

    S2          1000V         快速      30分钟                  除盐

    S3          8000V         线性      4小时                   升压

    S4          8000V         快速      40,000伏小时           聚焦

    S5          500V         快速      任意时间              保持

    选择所放置的胶条数;设置每根胶条的极限电流(50mA/根);设置等电聚焦时的温度(17℃)。

    17cm胶条:   水化       50V           1216小时(17℃)            主动水化

    S1         250V         线性      30分钟                除盐

    S2         1000V          快速      1小时                除盐

    S3         10000V         线性      5小时                   升压

    S4         10000V         快速      60,000伏小时          聚焦

    S5         500V         快速       任意时间             保持

      选择所放置的胶条数;设置每根胶条的极限电流(5070mA/根);设置等电聚焦时的温度(17℃)。

    10)聚焦结束的胶条。立即进行平衡,第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-70℃冰箱保存。

    10.2.3 SDS-PAGE

    1)配制10%12%的丙烯酰胺凝胶。注意保证每一块胶的大小一致,用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。

    2)待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。

    3)从-20℃取出胶平衡缓冲液母液使其溶解。

    4)配制胶条平衡缓冲液III。不同长度的胶条,所用的胶条平衡缓冲液体积可参考下表。

    胶条的长度

    7cm

    11cm

    17cm

    胶条平衡缓冲液I

    2.5ml

    4ml

    6ml

    胶条平衡缓冲液II

    2.5ml

    4ml

    6ml

    5)在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。如果是放在-70℃冰箱中的胶条,需先于室温放置10分钟,使其溶解。

    6)将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I,将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃1213分钟(>10min <15min)。

    7)第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I,并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃1213分钟(>10min <15min)。

    8)用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体,将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。

    9)将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

    10)将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

    11)第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II,并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

    12)将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。

    13)将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

    14)用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。

    15)放置几分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固,可以将胶板放在4℃以助其凝固

    16)在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后,将凝胶转移至电泳槽中。

    17)在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(2030mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

    18)电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。

    19)进行染色。

    虽然二维电泳的操作已经变得越来越简单,但是现阶段要得到较好的实验结果,经验因素仍然是不可或缺的。因此建议新接触二维电泳的同学做好充分的准备,多与有经验的同学交流。很少有同学第一次实验就可以做的很好的,因此在前期摸条件的过程中要注意总结经验教训,根据所跑出来的图进行有针对性的改进,这样可以快速上手,进步更快。

    10.3 二维电泳中所用缓冲液配方

    水化上样缓冲液(I):  尿素                   8M                4.805g

    CHAPS              4%                 0.4g

    DTT                65mM              0.098g(现加)

    Bio-Lyte             0.2%w/v       50ml40%)(现加)

    溴酚蓝             0.001%             10ml1% 溴酚蓝)

    MilliQ   定容至10ml;分装成10小管,每小管1ml,-20℃冰箱保存。

    水化上样缓冲液(II):  尿素                   7M                4.2g

    硫脲                2M                1.52g

    CHAPS              4%                 0.4g

    DTT                65mM              0.098g(现加)

    Bio-Lyte             0.2%w/v       50ml40%)(现加)

    溴酚蓝             0.001%            10ml1% 溴酚蓝)

    MilliQ   定容至10ml;分装成10小管,每小管1ml-20℃冰箱保存。

    水化上样缓冲液(III):尿素                  5M                     3.0g

    硫脲                2M                     1.52g

    CHAPS              2%                     0.2g

    SB 3-10             2%                     0.2g

    DTT               65mM                   0.098g(现加)

    Bio-Lyte            0.2%w/v            50ml40%)(现加)

    溴酚蓝            0.001%                 10ml1% 溴酚蓝)

    MilliQ   定容至10ml;分装成10小管,每小管1ml-20℃冰箱保存。

    胶条平衡缓冲液母液:  尿素              6M                36g

    SDS           2%             2g

    Tris-HCl        0.375M pH8.8       25ml1.5M pH8.8 Tris-HCl

    甘油           20%                20ml

    MilliQ水定容至100ml,分装成10管,每管10ml,-20℃冰箱保存。

    胶条平衡缓冲液I   胶条平衡缓冲液母液      10ml

    DTT                     0.2g     充分混匀,用时现配。

    胶条平衡缓冲液II   胶条平衡缓冲液母液      10ml

    碘乙酰胺                 0.25g     充分混匀,用时现配。

    低熔点琼脂糖封胶液:  低熔点琼脂糖      0.5%                      0.5g

    Tris                25mM                   0.303g

    甘氨酸              192mM                  1.44g

    SDS                0.1%                  1ml10% SDS

                        溴酚蓝              0.001%                  100ml1%溴酚蓝)

    MilliQ水定容至100ml,加热溶解至澄清,室温保存。

    30% 聚丙烯酰胺贮液:  丙烯酰胺        150g

    甲叉双丙烯酰胺   4g

         MilliQ         500ml   滤纸过滤后,棕色瓶4℃冰箱保存。

    1.5mol/L Tris pH8.8Tris         90.75g

    MilliQ400ml,用1mol/L HClpH8.8,再加MilliQ水定容至500ml4℃冰箱保存。

    10% SDS  SDS           10g

                MilliQ100ml,混匀后,室温保存。

    10% Ap   Ap            0.1g

              MilliQ1ml(用时加水溶解)溶解后,4℃冰箱保存。

    10×电泳缓冲液1×= 25mM Tris192mM glycine0.1% SDSpH8.3):

    Tris          30g

    甘氨酸              144g

    SDS                 10g

    MilliQ1L,混匀后,室温保存。

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