核酸操作
发布时间:2011年03月07日     点击次数::

5 核酸操作

5.1DNA酶切

DNA限制性内切酶可以识别短的DNA序列,并在识别序列内或旁侧特异性的切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为456个核苷酸,且为回文序列。一些酶切割DNA双链而产生带平端的DNA片段,而一些酶则在回文序列对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链,产生带有单链突出端(即粘端)的DNA片段。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件,甚至对同一种酶也如此。但是,几乎所有的生产厂家都提供其生产的酶制剂优化过反应条件,因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点,同时提供有酶切缓冲液(buffer)和最适反应条件。

影响限制性内切酶反应的因素很多,主要存在于DNA制品中的污染(如蛋白质、酚、氯仿等有机试剂;高浓度的盐离子等),这种抑制可以通过增加酶量、增大反应体积以稀释抑制物,以及延长反应时间来加以克服。此外,不同的酶具有不同的切割效率,可能受到酶切位点的侧翼序列的影响,具体需要查找酶的供应商的产品说明书。

普通的限制性内切酶消化DNA只需要按照产品说明书将DNA,缓冲液和酶按照要求的含量和体积混合,并在一定的温度下反应一定的时间即可。

限制性内切酶对DNA消化的一般方案:

1)限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

220μl体积反应体系如下:

DNA            0.21 μg

10×酶切buffer         2.0 μl

限制性内切酶         12 U(单位)

ddH2O           加至20μl

限制性内切酶最后加入,轻轻混匀,稍加离心,放置于最适温度水浴并按所需的时间温育,一般为37℃水浴消化1h

3)用于回收酶切片段时,反应总体积可达50200μl,各反应组分需相应增加。

4)多种酶消化时,若缓冲液条件相同,可同时加入;否则,先做低温或低盐的酶消化,再做高温或高盐的酶消化。

5)酶切结束时,加入0.5M EDTApH 8.0)使终浓度达10mM,以终止反应,或将反应管在65℃热浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。或者直接加入十分之一体积的醋酸钠(3MpH5.2)和二倍体积的无水乙醇沉淀DNA;如果是用于检测,则可以直接加入loading buffer

6)如消化反应体积过大,电泳时加样孔盛不下,可加以浓缩:终止反应后,加入0.6体积的5M乙酸铵(或1/10体积3M NaAc)和2倍体积无水乙醇,在冰上放置5min,然后于4℃下12000g离心5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中(pH 7.6)。

7)如要纯化消化后的DNA,可用等体积酚/氯仿(11)和氯仿各提取一次,再用乙醇沉淀。

【注意事项】

1)浓缩的限制性内切酶可在使用前以限制酶稀释缓冲液稀释,切勿用水稀释以免酶变性。

2)购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中,于-20℃是稳定的。进行酶切消化时,将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀,再从-20℃冰箱中取出酶,立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头,以免酶被污染。加酶的操作尽可能快,用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

3)尽量减少反应体积,但要确保酶体积不超过反应总体积的10%,否则酶活性将受到甘油的抑制。

4)通常延长时间可使所需的酶量减少,在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

5)注意星号酶切活力。

5.2DNA片段回收

质粒、噬菌体等经酶切和电泳,PCR产物经电泳后,常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化,并用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法、透析袋回收等。在常规操作中,目前主要采用离心柱式DNA胶回收试剂盒哎进行DNA片段的回收,其基本方法如下(具体操作请严格按照产品说明书进行):

DNA回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit Protocol):

1)紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶,置1.5ml离心管中,称重。

2)加入Buffer QG(每100mg凝胶加Buffer QG 300μl),置50℃水浴10min

3)若回收片段小于500bp或大于4kb,则需加入异丙醇(每100mg凝胶加异丙醇100μl),混匀。

4)将小柱放在2ml收集管上,将上述溶液加于柱上。

54℃下13000 rpm离心1min,去收集管中液体。

6)加入500μl Buffer QG于柱上,4℃下13000 rpm离心1min,弃去收集管中液体。

7)加入750μl Buffer PE于柱上,4℃下13000 rpm离心1min,弃去收集管中液体。

84℃下13000 rpm离心1min。弃去收集管。

9)将柱放于一新1.5ml离心管上,加50μl EB于柱上,放置1min4℃下13000 rpm离心1min

10)取5μl 回收DNA,电泳检测。

【注意事项】

1)紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时,要衬以干净的塑料薄膜,使用无DNA污染的新刀片,其目的在于防止外源DNA的污染。

2)溶胶后上柱的液体的pH值对DNA的结合效率很重要,目前部分公司已经在产品设计中提供了合适的pH值的颜色识别设计。

3)从膜上洗下结合的DNA可以用试剂盒提供的EBbμffer,也可用去离子水;后者更适合大体积的回收样品的后续酶学操作。

5.3DNA酶连

DNA酶连一般是将两个线性化的分子通过T4连接酶连接为一个分子的过程。在通常的分子克隆操作中,是将一段DNA片段与一个质粒载体通过相同的核酸内切酶消化,得到相同的互补的末端,或者通过核酸修饰得到平端的两个DNA分子连接为一个环状分子的过程。T4连接酶是目前唯一通用的在正常条件下能有效连接平端DNA的连接酶。

1)互补性粘性末端的连接:使用单一限制性内切酶或两种限制性内切酶(为同尾酶,如BamHIBglII)分别处理载体和外源DNA,可以得到的粘性末端为互补性突出末端。这种类型的酶连为互补性粘性末端的连接。由于存在互补的碱基可以形成氢键,互补性粘性末端有利于通过互补的氢键促进连接酶催化形成磷酸二酯键,外源片段和质粒载体DNA均容易发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物,且正反两种连接方向都可能有,从而降低酶连效率。一般将载体DNA和外源DNA的分子数比(浓度比)为1310之间,以增加酶连的效率。同时,载体DNA5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉,防止其自身环化。而带5’端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连,产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E.coli受体菌后该种缺口可在DNA复制过程种自动修复。

2)非互补粘性末端的连接:用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这样能避免质粒的自身环化,大大降低假阳性;同时能定向的插入外源片段;这是DNA重组中最容易克隆的DNA片段。该种粘性末端的连接载体DNA和外源DNA的分子数比(浓度比)通常为为11

3)平头末端的连接:是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生,或由DNA聚合酶补平产生的两个DNA片段的连接。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多,故在其连接反应中,T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下,外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配,也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

4DNA连接的影响因素

连接反应的影响因素包括温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。

①温度与时间:连接反应的一项重要参数是温度,理论上连接反应的最佳温度是37℃,此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的氢键配对结构极不稳定,因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性,又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即1216℃。一般粘性末端的连接在此温度下,反应30min即可取得较好的效果,如时间充裕的话连接60min则更完全些。为了实验方便,有时也在4℃条件下连接过夜。而对于平头末端的连接,建议在37℃条件下连接,并且时间适当延长。

②酶量:酶单位的定义在宝生物工程公司提供的T4-DNA连接酶中是指在20ml的连接发应体系中,6mgl DNA-HindIII的分解物在16℃下发应30min时,有90%以上的DNA片段进行连接的酶量为1U。由以上的定义可知,日常连接实验中的DNA的浓度比酶量定义的状态下低很多1020倍,所以实际酶量是过量的。平头末端的连接酶的用量要比粘性末端连接所需酶量大10100倍,因此厂商提供的连接酶浓度往往是高浓度的(宝生物的T4-DNA连接酶浓度350U/ml)。故从这个意义上分析,常规的粘性末端的连接反应体系中酶量的加入往往是过量的。

③缓冲体系:不同公司的连接酶缓冲液大部分含有Tris-HClpH 7.5),提供连接所需的合适pH值。另外在缓冲液中还有含两种非常重要的成份:DTTATP。前者提供一定的还原能力,而后者能促进连接反应的有效进行。但是在实验中缓冲液使用时的反复冻融会引起ATP的分解,从而影响连接效率。为了保证实验的顺利进行,一般大剂量的缓冲液可以分装成小管保存并使用,另外可考虑使用一段时间的缓冲液定期更新一下。

DNA浓度:DNA连接反应中建议的DNA连接浓度为0.11pmol/ml,而为了降低载体分子间的环化,载体DNA的浓度不宜过高,外源DNA的投入量则依据连接类型不同投入110倍。

5)常规DNA分子的连接

①用适当限制酶消化载体质粒和外源DNA,必要时用琼脂糖凝胶电泳分离片段。

②按设计的反应体系依次加入:载体片段、外源片段、10×T4-缓冲液、T4-DNA连接酶(酶要最后加入)。

建议连接体系(可根据样品浓度进行适当调整):

载体片段         1μl

外源片段        4μl

10×T4-缓冲液      1μl

T4-DNA连接酶     0.5μl

ddH2O         3.5μl

16℃保温24小时,然后转化感受态细胞

【注意】很多同学在酶连时候都遇到假阳性的问题,为了避免载体自连,除了对载体进行磷酸化以外,(这是很有效的方法),我们尝试过在酶连的时候加入载体特有而酶连产物没有的酶切位点的酶进行反应,或者酶连结束后,加入上述核酸内切酶及相应的buffer来切开自连的载体,提高阳性克隆的比例。

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