大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
发布时间:2011年03月07日     点击次数::
3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
    电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔,同时,DNA在电场力的作用下进入细胞,随后细胞复苏和弥合,从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”,即产生电流,细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为1091010 转化子/µg DNA
3.1.感受态细胞的制备

1)感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。

2)选合适的大肠杆菌在4℃,3000 rpm下离心10min,弃上清液(如需要,沉淀可在4℃的10%甘油中保存12天)。

3)弃上清,离心管中加入少量ddH2O,轻柔的悬浮沉淀后,再将水注满离心杯,4℃,3000 rpm离心10min

4)重复步骤(31次。

5)小心弃上清(沉淀可能会很松散),再往离心管中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油,4℃,4000 rpm离心10min

6)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为23ml,将细胞按200μl等份装入微量离心管,放置于-80℃下保存。

7)按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。                                                          

3.2.电转化

为了降低离子浓度,待转化的质粒DNA,如质粒或酶连产物,在电转化前应该进行纯化(乙醇沉淀),以下所有步骤都需要保持无菌操作。

1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;加入待转化的质粒DNA,冰浴10min;同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中,如果电转化杯浸泡在乙醇中,可提前取出电转化杯,在无菌的超净台上吹干。

2)打开电转仪,调至Manual,调节电压为2.1KV特别注意,不同的电转化杯,所使用的电压不同。防止电压不够,难以有效转化,以及,电压过高,击爆电转化杯,产生火花,产生危险。

3)将冰浴后的感受态细胞(含DNA)转移到电转化杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部(注意:其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可,具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明)。

4)将电极杯推入电转化仪中,按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入800μlLB液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中。

537℃,220250 rpm复苏40min

6)按照钙转步骤进行涂板培养。

【电击杯清洗流程】

1)用清水将电击杯稍冲一下。

2)向电击杯中加入75%酒精浸泡2h

3)去酒精,再用蒸馏水冲洗23遍,然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4)加入无水乙醇2ml于电击杯中,浸泡30min

5)去无水乙醇,于通风厨内挥发干乙醇。

6)将清洗好的电击杯放入-20℃冰箱内待用。

【注意】不同样品使用的电转化杯应分开;若长期不用,应将清洗好的电转化杯浸泡在乙醇中。

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