大肠杆菌感受态细胞的制备(钙转)及转化
发布时间:2011年03月07日     点击次数::
2 大肠杆菌感受态细胞的制备(钙转)及转化
   细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态被称之为感受态,一般认为处于感受态的细胞,其细胞膜的通透性增加,易于接受外源的DNA。质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入感受态细胞的过程通常被称之为转化。用于一般转化的感受态细胞应该是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株,并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配,这样能确保转入的DNA能够稳定复制,所携带的基因能顺利表达。钙离子介导的大肠杆菌的质粒转化主要基于:在0℃下的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞膨胀成球形,丢失部分膜蛋白,细胞膜通透性增加;钙离子同添加进来用于转化的质粒DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基钙磷酸复合物,此复合物容易粘附于细菌细胞表面,以增加进入细胞的几率;42℃短时间热处理(热休克),可以促进细胞吸收DNA复合物。进行转化操作的感受态细胞加入非选择性的液体培养基,在最适合生长温度(37℃)进行孵育和复苏,使得转入感受态细胞的外源DNA所携带的筛选标记等基因表达,以获得新的表型(如Amp抗性);最后将复苏后的大肠杆菌涂布在筛选培养基固体平板上进行筛选即可。钙离子的处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×1062×107转化子/μg质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn2+Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高1001000倍。

感受态细胞制备及转化影响的主要因素:

1)细胞的生长状态和密度。最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的培养物,而不要用已经多次转接,及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳,即应用对数期或对数生长前期的细菌。菌体密度可通过测定培养液的OD600进行粗略的评价。对大肠杆菌TG1菌株,OD6000.5时,细胞密度在5×107/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而有所不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。

2)质粒DNA的质量和浓度。用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的,转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,则会使转化率下降。一般来说,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%1ngDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量越大,转化效率相应降低。此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍,因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

3)试剂的质量。所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃。

4)杂菌及杂DNA污染防控。所有操作均需要保证严格无菌;所有涉及器皿,如离心管,移液器所有各种规格的tip头,均需要使用新购买或专用的,并经过严格高压湿热灭菌;所有的试剂也需要严格灭菌并防止被其他的试剂,DNA等污染。尤其值得注意的是,除了保证无菌以外,还要特别保证所有操作流程,所有涉及器皿的洁净度

5)保证所有操作过程,大肠杆菌材料出去冰浴状态;离心机,所需要的试剂,用于分装的离心管可以提前预冷。

2.1.感受态细胞的制备(钙转)

1)容器和试剂准备:新灭菌离心管(储存感受态细胞),制备感受态试剂(使用前务必预冷)。

2)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于35ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12h左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以150100的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养23hOD6000.5左右。

3)将培养液转入离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下3000 rpm离心10min。弃上清液,用预冷的0.05mol/LCaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置1530min后,4℃下3000 rpm离心10min

4)弃上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/LCaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几min,即成感受态细胞悬液。

5)感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-80℃可保存半年。

6)将感受态细胞按照正常步骤进行转化操作,并分别涂布无抗,及常用的抗生素的单抗平板,过夜培养,根据形成单菌落检测感受态细胞的抗性。

7)转化效率和抗性检测:将已知浓度的质粒按照一定稀释梯度转化感受态细胞,并在相应的平板上培养过夜,根据菌落数计算感受态转化效率。

转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积

转化频率(转化子数/mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数

【注意】

1)制作感受态细胞时,应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。由于微量的洗涤剂或污染物都可能降低感受态细胞的转化效率,因此在洗刷完用于制作感受态细胞的专用玻璃器皿或塑料容器后,最好用去离子水浸泡一晚,然后再充分洗净。

2)制作感受态细胞时,所使用的菌种,不应使用4℃或常温保存的传代细菌。应使用-70℃保存的菌种,在LB/抗生素平板培养基上分级划线培养后,挑取单菌落。使用这种菌种制作的感受态细胞,能提高转化效率。

3)培养感受态细胞制备用菌体时,OD600值的测定应随时进行,以使OD600值控制在0.350.5之间。如果OD600值超出此范围,可能降低感受态细胞的转化效率。

4)用于感受态细胞制备的菌体培养停止后要立即处理,不要将培养液过长时间室温下放置,在冰中放置时也不要时间过长。

5)感受态细胞的制备操作过程中,离心后弃上清时要尽量弃尽,否则会降低感受态细胞的转化效率。

6)氯化钙溶液也可以依次使用Solution ASolution B进行悬浮。

使用Solution ASolution B悬浮沉淀时,要用手指轻轻弹动离心管管壁,禁止剧烈震荡操作。

Solution A(重悬液):0.1M MgCl2-CaCl2溶液(0.08M MgCl2+0.02M CaCl2

Solution B(冻存液):0.1M MgCl2-CaCl2溶液+15%甘油(用Solution A配制)

7)本实验需全程在冰浴下进行,反复冻融会使细菌细胞破裂。

8)-80℃冰箱中可保存半年左右。但如果是在-20℃冰箱中,建议保存时间不要超过15d

2.2.质粒转化(钙转)

1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;加入待转化的质粒DNA或酶连产物,冰浴30min;同时打开水浴锅,调至42 ℃。

2)冰浴完成后,从冰中取出含DNA的感受态细胞,42℃热激 90 s。然后迅速冰浴约1min

3)加入800μL的无抗LB(可以事先置于37℃),然后在37℃,220250 rpm下复苏40min

4)复苏完成后,4000 rpm离心5min收集细胞,然后用约100μl无抗LB重悬,涂布到相应的选择性LB平板上,过夜培养。如果感受态效率很高,也可以不用收集细胞,直接将复苏后的培养物取合适体积涂布相应平板。

注意以上所有步骤都需要保持无菌操作。

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