核酸分离
发布时间:2011年03月07日     点击次数::
1 核酸分离
1.1.植物DNA的提取(陈桃)

百脉根总DNA的提取采用CTAB法进行提取,提取程序如下:

1)取适量(约1.3克)的低温保存的百脉根叶片,用液氮研磨成粉末状,分装于1.5 ml的离心管中。

2)取1 ml 95℃预热的1.5×CTAB加入研磨好的装有叶片组织的离心管内,小心混匀。

3)立即将离心管进行65℃水浴30 min,每5 min颠倒一次。

412000 rpm离心5 min;吸取上清液600μl至另外1.5 ml离心管内,加入等体积氯仿/异戊醇(241),颠倒至下层液相为深绿色。

512000 rpm离心5 min,取450μl上清夜至另外的1.5 ml离心管内,加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的10 M NaAc,摇匀。

612000 rpm离心10 min

7)弃上清液,加400μl无水乙醇浸洗沉淀5 min

8)弃上层溶液,风干。

9)加入40μlRnase的无菌水。

1.2.酵母DNA的提取(陈桃)

1)接单菌落至5mlYPD30℃,225 rpm过夜培养。

212000 rpm离心15s收集菌体,加1ml纯水洗涤。

3)将菌溶于500μl Lysis buffer,加入酸洗过的细小玻璃珠至1.25ml,震荡2min

4)加入pH7.07mol/L的醋酸铵275 μl,混合后于65℃加热5min,置冰上5min

5)加入500 μl氯仿,混匀后离心5min

6)吸上清,1ml异丙醇沉淀,室温放置5min12000 rpm离心5min

70%乙醇等体积沉淀,抽干,加入30μl水。

Lysis buffer100ml

Triton-x-100           2ml

10%SDS            10ml

5M Nacl            2ml

1M Tris-Hcl(pH 8.0)       1ml

0.5M EDTA          0.2ml

H2O             84.8ml

1.3.细菌(病毒)RNA提取(刘力强)

卡介苗(BGC)的RNA提取:BGCG+菌中也是算比较难提取的,主要是其细胞壁太厚,一般的方法比较难破壁。对于RNA的提取,不论是用TRIZOL,还是试剂盒,说明书上都有比较详细的操作步骤,对于一般的常见样品(细胞、大肠杆菌等)都能得到比较好的效果。RNA的提取,关键步骤之一是样品的前处理。前处理的目的是使RNA从细胞中完整的释放出来并且使RNA的释放过程中尽量减少被Rnase的降解。如果前处理做好了,RNA的提取再按照试剂盒说明书的步骤来,几乎都能成功。这里主要介绍对于细胞壁太厚,需要研磨的材料的前处理,以BGC为例。提取BGCRNA前处理,采用液氮研磨法,其步骤如下:

1)将研磨用具牛皮纸包好干灭。

2)将研磨用具使用前在-80℃下预冻1h以上。

3)将BGC(最好对数生长期)4℃,13000 rpm离心2min收集菌体,准备研磨。

(下面的操作越迅速越好,并注意做好防护,避免冻伤)

4)将预冷的研钵取出,倒入液氮,铺满研钵底部,大约20ml左右即可,迅速刮出离心管里的菌体置于钵内,用研杵研磨。菌体在液氮下会被冻脆,很容易研磨成粉末。(注:菌体尽量干燥,有水会使得研磨困难;若研磨时间过长,可在研磨途中适当补加液氮,尽量不让液氮挥发干;研磨可在冰上进行)。

5)用勺子迅速将研好的粉末刮入Rnase-freeEP管中,立即加入试剂盒中配好的裂解液,混匀(若是用TRIZOL提取,则加入合适量的TRIZOL即可)。(注:①也可将TRIZOL加入研钵中研磨到TRIZOL融化,然后将液体吸入EP管中。试剂盒提取时,由于加入的裂解液量较少,不建议把裂解液加入研钵中。②病毒RNA提取直接取病毒原液加入10倍体积TRIZOL即可)。

6)接下来的步骤可按照说明书操作即可。

以下提供用TRIZOL的提取步骤

7)室温放置5min,再按每毫升TRIZOL0.2毫升的氯仿,盖紧EP管后剧烈振荡15s

8)取上层水相于另一EP管(宁可少取,不要吸到下层物质),按每毫升TRIZOL0.5毫升异丙醇后室温放置10min

912000 rpm离心10min后弃上清,按每毫升TRIZOL至少加入1ml75%乙醇,混匀后4℃下7500 rpm离心5min。重复该步骤1次。

10)弃上清,室温干燥510min(注:过度干燥会降低RNA溶解度)。

11)将RNA溶于Rnase-free的水中,分装后在-80℃保存。

121%琼脂胶(含0.1%(V/V)左右的EB),1x TAE缓冲液(最好用DEPC水配制),加样2μg左右,90100V电压下琼脂糖凝胶电泳检测。

【注意】提RNA要勤换手套,最好戴口罩,尽量在人少的时候中提取,提取时候操作尽量迅速。                          

1.4.结核分枝杆菌H37Rv的培养及基因组DNA的提取(李雨庆)

1)取结核分枝杆菌H37Rv菌种1 ml加入到100 ml 无菌7H9液体培养基中。

237℃静置培养约24周。

3)将50 ml液体培养的结核杆菌在80℃水浴1h灭活细菌。

(以上步骤须在P3实验室内进行)

4)室温,12000 rpm离心2 min

5)弃上清,加入10 ml 1×TE重悬细菌。

6)室温,12000 rpm离心2 min

7)弃上清,用3 ml 1×TE重悬细菌,加溶菌酶至终浓度5 mg/ml37℃振荡2 h

8)加入蛋白酶K至终浓度1 mg/ml,加入10% SDS至终浓度1%37℃振荡过夜。

9)待冷却至室温后,加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25241),缓慢翻转10 min混合两相形成乳浊液。

104℃,12000 rpm离心10 min分离两相。

11)将上清转移到另一离心管,加入等体积的氯仿∶异戊醇(241),缓慢翻转混匀两相10 min

124℃,12000 rpm离心10 min

13)将上清转移到另一离心管,加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠溶液(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃过夜。

144℃,12000 rpm离心20 min

15)弃上清,沉淀用75%乙醇漂洗1次,真空抽干或自然干燥,加入适量无菌去离子水,溶解后的DNA贮存于-20℃。

1.5.鱼腥蓝细菌DNA的分离(蓝细菌组)

【试剂】

TES15ml 1M Tris.ClpH8.0+0.6ml 0.5M EDTApH8.0+75g蔗糖定容到300ml

TEN30ml 1M Tris.ClpH8.0+60ml 0.5M EDTApH8.0+2.6325g蔗糖定容到300ml

TEpH7.5):5ml 1M Tris.ClpH8.0+1ml 0.5M EDTApH8.0),用浓盐酸调节pH值至7.5;定容到300ml

3M NaAc122.472g NaAc,定容到300ml

10%SDS50g SDS加水定容到500ml

  操作步骤:

1)收集对数生长后期的蓝细菌培养物,8000 rpm离心2min,弃上清。

2)将沉淀转移至2ml离心管中,10000 rpm离心1min,去上清。

3400μlTES溶液悬浮沉淀,加入1%sarkosyl,使最终浓度为0.1%37℃温浴2小时(注:对于Anabaena 步骤3可省)。

4)用1ml TEN溶液洗菌2次,10000 rpm离心1min,去上清。

5)用500μlTEN悬浮菌体,加入溶菌酶使终浓度为0.5mg/ml37℃温浴1小时。

6)加入10%SDS使终浓度为1%,加入20mg/ml的蛋白酶K使得最终浓度为0.5mg/ml37℃温浴1小时。

7)加入等体积的苯酚∶氯仿,涡旋,12000 rpm离心5min,收集上清液。再重复(7)步骤 2次。

8)加入等体积的氯仿提取1次,12000 rpm 离心5min,收集上清液。

9)加入1/10体积的NaAc(醋酸钠)2.5倍体积的无水乙醇,-20℃下存放1030min12000 rpm离心5min,弃上清。

10)用70%的乙醇暂短浸泡,短暂离心,弃上清。

11)沉淀风干后,重溶于50μlTE中待用。

1.6.苏云金芽胞杆菌总DNA的提取(芽孢杆菌课题组)

1)经活化的菌,接种于5ml LB液体培养基中(注意有的需要加相应的抗生素)。

2)生长至对数中期(4h)收集菌体(12000 rpm/30s),STE洗涤1次。

3)菌体悬于100μL 溶液I,加510μL溶菌酶液(浓度50100mg/ml)。冰上静置23h或过夜。

4)加200μL 2SDS5560℃,温浴30min

5)加100μL 5MNaCl溶液,混匀,室温或者冰上静置510min

612000 rpm离心5min,取上清液。

7)苯酚:氯仿:异戊醇(25241)提取23次,12000 rpm离心5min,取上层液体。

8)二倍体积无水乙醇沉淀,-20℃,15min2h

912000 rpm离心5min,弃上清液。

10)用70%乙醇沉淀1次,真空抽干。

11)沉淀溶于20μL RNase 液中(20μg /ml)。

1235μL 点样电泳,检测。
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